A riboflavina é utilizada como corante alimentar, sob a designação E101 ou E101a (quando na forma fosfatada). A deficiência em riboflavina provoca rachaduras nos cantos da boca e nariz, estomatite, coceira e ardor nos olhos, inflamações das gengivas com sangramento, língua arroxeada, pele seca, depressão, catarata, letargia e histeria.

A riboflavina é necessária na síntese do dinucleótido de flavina-adenina (FAD) e do mononucleótido de flavina (FMN), dois cofactores enzimáticos essenciais no funcionamento de enzimas importantes em diversas vias metabólicas. É uma molécula fotossensível, degradando-se na presença de luz.