Foram instituídos tribunais territoriais com jurisdição exclusiva para todos os casos de heresia. Acima deles, foi fundado um organismo central com sede em Roma composto de sete cardeais e sob o controle direto do pontífice, que participava de todas as sessões. O organismo podia investigar também outros prelados e tinha jurisdição em todo o território cristão, mas na verdade tratou principalmente das questões italianas.

No início, a atividade da Inquisição romana limitou-se a Itália, mas quando Gian Pietro Carafa foi eleito papa, como Paulo IV em 1555, começou a perseguir muitos suspeitos de heterodoxia, entre os quais vários membros da hierarquia, como o cardeal inglês Reginald Pole. Em 1600, foi julgado, condenado e executado o filósofo Giordano Bruno. Em 1633, foi julgado e condenado Galileo Galilei, que morreu em prisão domiciliar.