É um animal crepuscular e solitário. É um importante predador e pode comer qualquer animal que seja capaz de capturar, desempenhando um papel na estabilização dos ecossistemas e na regulação das populações de espécies de presas. Porém, tem preferência por grandes herbívoros, podendo atacar o gado doméstico. Frequentemente convive com a onça-parda (Puma concolor), influenciando os hábitos e comportamento deste outro felino. Caça formando emboscadas. A área de vida pode ter mais de 100 km², com os machos tendo territórios englobando o de duas ou três fêmeas. A onça-pintada é capaz de rugir e usa esse tipo de vocalização em contextos de territorialidade. Alcança a maturidade sexual com cerca de 2 anos de idade, e as fêmeas dão à luz geralmente a dois filhotes por vez, pesando entre 700 e 900 gramas. Em cativeiro, a onça-pintada pode viver até 23 anos, mais do que em estado selvagem.

A IUCN considera a espécie como "quase ameaçada", dado sua ampla distribuição geográfica, mas suas populações estão caindo, principalmente por causa da perda e fragmentação do seu habitat. Entretanto, localmente ela pode estar em sério risco de extinção, como em áreas da América Central e do Norte e na Mata Atlântica brasileira. O comércio internacional de onças ou de suas partes é proibido, mas o felino ainda é frequentemente caçado por fazendeiros e agricultores na América do Sul. Apesar de ter se reduzido, sua distribuição geográfica ainda é ampla, e há boas chances de sobrevivência da espécie a longo prazo na Amazônia e no Pantanal. Ela faz parte da mitologia de diversas culturas indígenas americanas, incluindo a dos maias, astecas e guaranis e a caça à onça-pintada é uma atividade carregada de simbolismo, principalmente entre os pantaneiros.