Nachtigal nacque a Eichstädt, nella Marca del Brandeburgo, il 23 febbraio 1834. Figlio di un pastore luterano, studiò medicina alle università di Halle, Würzburg e Greifswald. Dopo la laurea prestò servizio come chirurgo nell'esercito. Per motivi di salute gli fu consigliato di trasferirsi in un paese con un crima più caldo, e visse ad Algeri e Tunisi, prendendo anche parte a diverse spedizioni nell'interno del Nordafrica.